Roepat Str - Geschichte

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Roepat

(Str: dp. 16,100; 1. 466'0", T. 55'11", dr. 28'9", s. 11 k.; kpl. 70; T. 1 5", 1 3")

Roepat (Id. No. 2536), 1914 von William Hamilton & Co., Ltd., Glasgow, Schottland, für den Dienst als Duteh-Tiertransportschiff gebaut, wurde von US-Zollbeamten beschlagnahmt, übernommen und als Naval Overseas in Dienst gestellt Transportdienstschiff 17. Mai 1918 in New York.

Nach der Umrüstung und Neuausstattung lud Roepat ein Ohr mit allgemeinem Armeematerial und segelte am 2. Juni im Konvoi nach Brest und St. Nazaire, wo sie ihre Ladung entlud. Sie kehrte am 30. Juli im Konvoi nach New York zurück.

Sie lud Armeevorräte in Norfolk ein und segelte im Konvoi von New York am 17. August nach Marseille, wo sie am 6. September ankam, um ihre Ladung zu löschen. Sie kehrte am 18. Oktober nach New York zurück, um Reparaturen durchzuführen und Armeefracht nach Verdon zu verladen, wo sie am 18. November ankam. Sie kehrte am 22. Dezember nach Norfolk zurück.

Sie lud eine Ladung für das Shipping Board Account in Baltimore ein, bunkerte in New Orleans und fuhr am 5. Februar 1919 über Newport News nach Cette. Sie entlud ihre Ladung Weizen und Getreide, die am 4. März an die Schweizer Regierung geschickt worden war, kehrte am 6. Mai nach New York zurück und unterzog sich einer Reparatur.

Roepat segelte am 24. Mai nach Portland, Maine, wo sie eine Ladung für das Shipping Board lud, und segelte am 29. nach Amsterdam, wo sie am 28. Juni ankam. Am 30. Juni wurde Roe pat außer Dienst gestellt und an ihren Besitzer Nederland Stoomvaart Maats chappij zurückgegeben.


Einführung in die kurze Tandemwiederholung

Ich hoffe, dass alle gesund und munter in diesen unglücklichen Zeiten bleiben. Mein letzter Post bezog sich darauf, ein neuer MLS-Absolvent zu sein und meine Karriere als Molekulartechnologe am Transplantationslabor der Northwestern University zu beginnen. Die Zeit vergeht definitiv wie im Flug!

Heute werde ich eine grundlegende Einführung in einen Assay geben, in dem ich kürzlich trainiert wurde, genannt Short Tandem Repeat (STR). Wenn Sie einen Blick auf Ihr Genom werfen würden, wäre es mit vielen sich wiederholenden Sequenzen übersät. Während es viele verschiedene Klassifikationen von Wiederholungssequenzen gibt, sind STRs eine Art von Tandem-Wiederholungssequenz, bei der jede Wiederholung ungefähr 2 bis 7 Nukleotide lang ist. 1,2,3 STR ist in der Forensik dafür bekannt, einen Verdächtigen am Tatort zu identifizieren, wenn verschiedene DNA-Quellen vorhanden sind. Dennoch gibt es viele Anwendungen – von der Zelllinienbestätigung über väterliche Tests bis hin zur Chimärismusanalyse! 4

Bild 1. Elektropherogramm mit zwei verschiedenen Allelen (11 und 17) innerhalb eines Locus (D6S1043). Allel 11 hat 11 Wiederholungen und Allel 17 hat 17 Wiederholungen.

STRs sind polymorph, eine nützliche Eigenschaft von vielen, die ihre Verwendung bei der Identifizierung der DNA-Quelle besonders vorteilhaft macht. Ein STR-Allel wird durch die Anzahl der Wiederholungen der oben definierten sich wiederholenden Sequenz definiert. (Bild 1). 1 Individuen sind an jedem Locus entweder heterozygot oder homozygot. Wenn die Anzahl der ausgewerteten STR-Loci zunimmt, nimmt die statistische Aussagekraft der Diskriminierung zu und die Wahrscheinlichkeit, dass eine andere Person das gleiche Profil hat, wird immer unwahrscheinlicher und die Erkennung kleiner Unterschiede nimmt zu. 3,4 In unserem Labor evaluieren wir insgesamt 21 verschiedene Loci!

Darüber hinaus verwenden wir in unserem HLA-Labor STR, um den Chimärismus-Status bei Patienten zu überwachen, die sich einer allogenen Stammzelltransplantation unterzogen haben. Vor ihrer Transplantation werden Patienten über ihr HLA-System (anders als STR) einem Spender zugeordnet. Sobald eine HLA-Übereinstimmung bestätigt ist, verwenden wir die Vortransplantation des Patienten und die Probe des Spenders, um informative STR-Allele zu generieren. Informative Allele sind Allele, die nur beim Empfänger und nicht beim Spender vorhanden sind. Diese Allele sind wichtig, da Stammzelltransplantationen das Knochenmark des Empfängers ersetzen und der Nachweis von Empfänger-DNA in Proben nach der Transplantation entscheidend ist, um eine Abstoßung oder einen Rückfall ihrer Krankheit zu erkennen. Darüber hinaus werden Loci, die informative Allele enthalten, als informative Loci definiert, dies sind die Loci, die dann verwendet werden, um den prozentualen Chimärismus zu identifizieren (Bild 2).

Bild 2. Spender und Empfänger (vor der Transplantation) sind in den ersten beiden Elektropherogrammen dargestellt. Die grünen „D1R“-Tags stehen für gemeinsame Allele, die blauen „D1“-Tags für spenderspezifische Allele und die braunen „R“-Tags für empfängerspezifische Allele. Im ersten Locus, AMEL, gibt es keine informativen Allele und daher ist es kein informativer Locus. Im nächsten Locus, D3S1358, gibt es ein gemeinsames Allel, 15, ein Spenderallel, 17, und ein informatives Empfängerallel, 18. Informative Loci haben informative Empfängerallele und können das Vorhandensein von Empfänger-DNA in einer Probe nachweisen – in in diesem Fall sind alle folgenden Loci nach AMEL informative Loci. CD3 (Post-Transplantation) ist auf dem dritten Elektropherogramm dargestellt. In diesem Beispiel ist klar, dass der Patient eine Art von Transplantatversagen oder ein Wiederauftreten seiner Krankheit hat, weil seine eigenen Zellen und nicht nur der Spender vorhanden sind.

Wenn Empfängerzellen wieder auftauchen, können wir die relativen Allelpeaks erkennen und sie dem Empfänger oder Spender zuordnen, indem wir auf die informativen Allele verweisen. Allelpeaks werden dann durch Gleichungen in unserer Software verwendet, die die Fläche unter diesen definierten Peaks messen und dann einen Donorprozent-Chimärismus berechnen. Sobald dieser informative Bericht erstellt wurde, können wir jede weitere Probe nach der Transplantation vergleichen, um den Chimärismusstatus des Patienten zu bestimmen (Bild 2).

Interessanterweise isolieren wir die DNA nicht einfach aus dem Buffy nach der Probe, wie wir es bei anderen Proben tun würden. Stattdessen unterteilen wir jedes Post-Sample in insgesamt drei Unter-Samples. Der erste ist einfach das periphere Blut des Patienten – nichts Besonderes. Die anderen beiden werden aus dem Rest des peripheren Blutes, das nicht verwendet wurde, in zwei separate Zelllinien isoliert – Lymphozyten (CD3+) und Myelozyten (CD33+). Dieser Vorgang ist äußerst arbeitsintensiv, da ein Satz von bis zu 8-12 Patienten gleichzeitig bearbeitet werden kann und jeder Satz bis zu 4-5 Stunden dauert.

Der Prozess beginnt mit der Aliquotierung von peripherem Blut für die DNA-Isolierung (Probe 1) und der Entnahme des Rests und der Schichtung über ein Lymphozyten-Trennmedium (LSM). Dann Ernten der Lymphozyten/weißen Zellschicht aus dem heruntergeschleuderten LSM. Anschließend fügen wir CD3- und CD33-Antikörper-Selektionscocktails und magnetische Beads hinzu. Dann führen wir eine Reihe von Waschvorgängen mit Magneten durch und erhalten schließlich unsere gereinigten CD3- und CD33-Zellpopulationen. Ihre Reinheit wird durch Durchflusszytometrie bestimmt, eine wichtige Komponente, um zu bestätigen, dass unsere Leukozyten-Untergruppen nicht mit anderen Leukozyten-Populationen kontaminiert sind – da eine Kontamination den Zweck der Analyse verschiedener Abstammungslinien zunichte machen würde.

Schließlich nehmen wir die isolierte DNA aus den drei Teilproben und amplifizieren sie mit spezifischen Primern und Fluoreszenz-Tags durch PCR. Dann werden die Proben auf ein Kapillarelektrophoresegerät geladen. Dieses Instrument erkennt jede Fragmentlänge, die durch die Primer und die Wiederholungen darin definiert wird, und ist in der Lage, diese Fragmente durch Größe, Fluoreszenz-Tags, Laser und Detektoren zu identifizieren. Das Instrument generiert dann Daten, die wir zu unserer Analyseplattform ChimerMarker übertragen können. Dadurch können wir die Daten analysieren und unsere klinischen Berichte erstellen.

Obwohl er extrem zeitintensiv ist, ist der linienspezifische Chimärismus bei der Stammzelltransplantation von entscheidender Bedeutung, da er informativer und empfindlicher ist als die vollständige Leukozytenanalyse – und um mehrere Größenordnungen empfindlicher ist als die Analyse nur des peripheren Bluts allein. Es ermöglicht die frühzeitige Erkennung kleiner chimärer Zellpopulationen, die andernfalls unentdeckt bleiben könnten, da eine Untergruppe im peripheren Blut eine andere Untergruppe mit steigendem Prozentsatz an Empfängerzellen „maskieren“ kann. Die frühestmögliche Diagnose dieser kleinzelligen chimären Zellpopulationen ist entscheidend für therapeutische Interventionen und die Verringerung von Transplantatabstoßungen. 2,5,6

Darüber hinaus ist nicht nur ihr Nachweis wichtig, sondern durch unsere Analyse können wir den Prozentsatz an Spenderzellen und Empfängerzellen berechnen. Wir berichten oft den Spenderprozentsatz (%) Chimärismus. Zum Beispiel könnte ein Patient 322 Tage nach der Transplantation einen Spenderchimärismus von 96 % in seinem peripheren Blut, 100 % in seiner CD33-Abstammung und 73 % in seiner CD3-Abstammung aufweisen. Am Tag 364 nach der Transplantation können sie dann 100 % in ihrem peripheren Blut, 100 % in ihrer CD33-Abstammung und 92 % in ihrer CD3-Abstammung aufweisen. Zwei Dinge, die in diesem Beispiel zu beachten sind, sind, dass sich die Prozentsätze ändern (in diesem Fall der Spenderchimärismus zunimmt) und dass das periphere Blut in der zweiten Probe nach 364 Tagen 100% Chimärismus ausdrückte, aber wenn wir uns speziell die CD3-Subpopulation ansehen nach 364 Tagen waren noch 8% der Empfängerzellen vorhanden (Bild 3 und 4).

Bild 3. Proben 322 Tage nach der Transplantation. Peripheres Blut meldet 96% Spender-Chimärismus. CD3 und CD33, gereinigt aus peripherem Blut, zeigen 73 % bzw. 100 % Spenderchimärismus. Abbildung 4. Proben 364 Tage nach der Transplantation, derselbe Patient wie in Abbildung 3 oben. Peripheres Blut meldet 100 % Spender-Chimärismus. CD3 und CD33, gereinigt aus peripherem Blut, zeigen 92 % bzw. 100 % Spenderchimärismus.

Einige Studien haben sich nicht nur auf die Entwicklung der Prozentsätze konzentriert, sondern auch auf ihre relative Prozentkonstellation. Zum Beispiel fand eine Studie heraus, dass vermehrte Empfänger-CD3-Zellen einen erhöhten Vorhersagefaktor für die Transplantatabstoßung hatten. Es wurde auch festgestellt, dass weitere Sub-Leukozyten-Populationen diese Vorhersagekraft erhöhten. 5 Darüber hinaus gab es einige Studien, die den Chimärismus und seine Nützlichkeit bei der Vorhersage der Graft-versus-Host-Reaktion (GvHD) untersucht haben. Diese Krankheit wird dadurch definiert, dass Spenderleukozyten die Leukozyten und Gewebe des Empfängers angreifen. Aufgrund dieser und anderer Erkenntnisse ist das Potenzial und die Anwendbarkeit der Chimärismus-Überwachung für die Patientenversorgung während ihrer Transplantationsprogression äußerst entscheidend. 2,5,6,7

Während das Engraftment ein sehr dynamischer Prozess ist, der je nach Individuum und Krankheitstyp variiert, ist das Engraftment-Monitoring eine Möglichkeit, therapeutische Ansätze zu überwachen und letztendlich zu beeinflussen. 2,5,6 Ich bin stolz darauf, zu dem wunderbaren Team hier an der Northwestern University beitragen zu können und bemühe mich, mehr über den Prozess zu erfahren – sowohl in der Klinik als auch im Labor. In zukünftigen Artikeln hoffe ich, näher auf den Prozess und andere Assays, die wir durchführen, eingehen zu können.

Danke fürs Lesen! Bis zum nächsten Mal! Bleiben Sie gesund und sicher in diesen unsicheren Zeiten!

  1. Lebenstechnologien. 2014. DNA-Fragmentanalyse durch Kapillarelektrophorese. Thermo Fisher Scientific. http://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf.
  2. Kristt, D., Stein, J., Yaniv, I., &. Klein, T. (2007). Bewertung des quantitativen Chimärismus im Längsschnitt: technische Überlegungen, klinische Anwendungen und routinemäßige Durchführbarkeit. Knochenmarktransplantation, 39(5), 255–268. doi: 10.1038/sj.bmt.1705576
  3. Clark, JR, Scott, SD, Jack, AL, Lee, H., Mason, J., Carter, GI, Pearce, L., Jackson, T., Clouston, H., Sproul, A., Keen, L. , Molloy, K., Folarin, N., Whitby, L., Snowden, JA, Reilly, JT and Barnett, D. (2015), Monitoring of chimerism after allogeneic haematopoetic stem cell transplantation (HSCT): Technical Recommendations for the use of Short Tandem Repeat (STR) based technologies, im Auftrag des United Kingdom National External Quality Assessment Service for Leucocyte Arbeitsgruppe Immunphänotypisierung Chimärismus. Br. J. Haematol, 168: 26-37. doi:10.1111/bjh.13073
  4. Kurze Tandem-Wiederholungsanalyse im Forschungslabor. (2012). Abgerufen am 10. April 2020 von https://www.promega.com/resources/pubhub/short-tandem-repeat-analysis-in-the-research-laboratory/
  5. Breuer, S., Preuner, S., Fritsch, G., Daxberger, H., Koenig, M., Poetschger, U., … Matthes-Martin, S. (2011). Frühe Empfänger-Chimärismus-Tests in den T- und NK-Zelllinien zur Risikobewertung einer Transplantatabstoßung bei pädiatrischen Patienten, die sich einer allogenen Stammzelltransplantation unterziehen. Leukämie, 26(3), 509–519. doi: 10.1038/leu.2011.244
  6. Buckingham, L. (2012). Molekulare Diagnostik: Grundlagen, Methoden und klinische Anwendungen. Philadelphia: F. A. Davis Company.
  7. Rupa-Matysek, J., Lewandowski, K., Nowak, W., Sawiński, K., Gil, L., &. Komarnicki, M. (2011). Korrelation zwischen der Kinetik des CD3-Chimärismus und der Inzidenz der Graft-versus-Host-Krankheit bei Patienten, die sich einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation unterziehen. Transplantationsverfahren, 43(5), 1915-1923. doi: 10.1016/j.transproceed.2011.02.011

-Ben Dahlstrom ist ein Absolvent des NorthShore University HealthSystem MLS-Programms. Derzeit arbeitet er als Molekulartechnologe für die Northwestern University in deren Transplantationslabor und führt HLA-Typisierungen von Knochenmark- und festen Organtransplantaten durch. Seine Interessen umfassen Mikrobiologie, Molekulare, Immunologie und Blutbanken.


Diskussion

Die erste DNA-Typisierungstechnologie, die Mitte der 1980er Jahre eingeführt wurde, war RFLP. Das RFLP-Verfahren zur DNA-Typisierung umfasste Kerneinheiten von Sequenzen, die aus 30 bis 100 Nukleotiden bestehen, die in vielen Wiederholungen (VNTR) vorhanden sind. Das RLFP-Verfahren zur DNA-Typisierung erfordert intakte genomische DNA in großen Mengen (20 bis 30 mg). Die biologischen Proben, die in einem forensischen Labor eingehen, sind jedoch normalerweise umweltschädlich und gelegentlich können nur geringe Mengen an DNA gewonnen werden. Daher konnte das RFLP-Verfahren in vielen Situationen nicht angewendet werden.

Das derzeit verwendete DNA-Typisierungsverfahren ist die STR-Typisierung. Bei dieser Methode können viele Loci, die aus Kerneinheiten von Nukleotiden bestehen, die bis zu einer Länge von 80 bis 400 Basenpaaren wiederholt werden, co-amplifiziert werden und die Ergebnisse können am selben Tag durch automatisierte DNA-Fragmentanalysen erhalten werden. Diese Technologie ist der RFLP-Methode überlegen, da sie winzige DNA-Mengen (0,5 bis 1 ng) benötigt und auch degradierte Proben getestet werden können.

DNA-Analysen haben dazu beigetragen, Verurteilungen in Hunderten von Gewaltverbrechen sicherzustellen, von Tötungsdelikten bis hin zu Körperverletzungen. Es hat auch dazu beigetragen, Verdächtige zu eliminieren und hat zur Entlastung und Freilassung zuvor verurteilter Personen geführt. DNA kann Ermittlungen fokussieren und wird wahrscheinlich Gerichtsverfahren verkürzen und zu Schuldgeständnissen führen. Es könnte auch einige Täter davon abhalten, schwere Straftaten zu begehen. Die verstärkte Verwendung forensischer DNA-Beweise wird zu langfristigen Einsparungen für das Strafjustizsystem führen.

Durch die Speicherung von DNA-Daten in Computerdatenbanken kann die DNA-Analyse verwendet werden, um Verbrechen ohne Verdächtige aufzuklären. Forensiker können DNA-Profile biologischer Beweise mit einer Datenbank vergleichen, um die Polizei bei der Ermittlung von Verdächtigen zu unterstützen. Eine Datenbank würde es auch ermöglichen, ungeklärte frühere Straftaten aufzuklären, bei denen DNA-Beweise gefunden wurden, die jedoch nicht mit dem Täter in Verbindung gebracht wurden, wenn DNA-Proben, die einem Verdächtigen im Zusammenhang mit einer späteren Straftat entnommen wurden, mit den am Tatort der früheren Straftat gefundenen Beweisen übereinstimmen . Eine nationale DNA-Datenbank würde der Polizei auch dabei helfen, Serientäter innerhalb und im ganzen Land zu identifizieren.

Forensische DNA-Analysen werden weltweit durchgeführt. Daher ist es seitens der Entwicklungsländer, einschließlich Malaysias, zwingend erforderlich, eine nationale DNA-Datenbank zu entwickeln und zusammenzustellen, die aus dem 𠇌rime Scene DNA Profile Index”, dem 𠇍NA-Profilindex der verurteilten Straftäter” und einem Index mit DNA-Profilen von . besteht unbekannte Körper und Körperteile. Diese Bemühungen wiederum werden angemessene Änderungen der Strafgesetze rechtfertigen, um Strafverfolgungsbehörden dabei zu helfen, Personen zu identifizieren, die mutmaßliche schwere und gewalttätige Straftaten begangen haben, und die Sammlung von Proben für die DNA-Profiling-Datenbank zu ermöglichen. Bis heute liegen bereits Daten für 9 STRs für drei ethnische Bevölkerungsgruppen Malaysias (Malays, Chinesen und Inder) (21, 22) vor und es werden derzeit Anstrengungen unternommen, um Subpopulationen von Malaien zu typisieren und das neu validierte 15 STR-Profiling zu starten Kit in verschiedenen Populationen in Malaysia. Umfangreiche Datenbanken und DNA-Profile von Kriminellen und deren Indexierung werden dazu beitragen, die Aufdeckung von Straftaten zu beschleunigen.


So funktionieren DNA-Beweise

Vom Tatort gelangt ein DNA-Beweis in ein forensisches Labor. Diese Labs unterscheiden sich stark, sowohl in ihrer Struktur als auch in Bezug auf die Art der Analysen, die sie anbieten. Öffentliche Laboratorien sind oft mit einer Strafverfolgungsbehörde oder der Staatsanwaltschaft verbunden, während andere unabhängige Regierungsbehörden sind. Es gibt auch private forensische Laboratorien, von denen einige nur der DNA-Analyse gewidmet sind.

Viele Labore haben die Möglichkeit, Tests an nuklearer DNA durchzuführen, bei der es sich um die Kopie der DNA handelt, die im Kern jeder Zelle vorhanden ist. Aber nur wenige Labore bieten spezialisiertere Techniken wie die Y-Chromosom- oder mitochondriale DNA-Analyse an. Sehen wir uns einige dieser Techniken genauer an.

Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) war eine der ersten forensischen Methoden zur DNA-Analyse. Es analysiert die Länge von DNA-Strängen, die sich wiederholende Basenpaare enthalten. Diese Wiederholungen sind bekannt als Tandemwiederholungen mit variabler Anzahl (VNTRs), weil sie sich ein- bis 30-mal wiederholen können.

Bei der RFLP-Analyse müssen die Forscher die DNA in einem Enzym auflösen, das den Strang an bestimmten Stellen bricht. Die Anzahl der Wiederholungen beeinflusst die Länge jedes resultierenden DNA-Strangs. Die Forscher vergleichen Proben, indem sie die Längen der Stränge vergleichen. Die RFLP-Analyse erfordert eine ziemlich große DNA-Probe, die nicht mit Schmutz kontaminiert wurde.

Viele Labore ersetzen die RFLP-Analyse durch kurze Tandemwiederholung (STR) Analyse. Diese Methode bietet mehrere Vorteile, aber einer der größten ist, dass sie mit einer viel kleineren DNA-Probe beginnen kann. Wissenschaftler amplifizieren diese kleine Probe durch einen Prozess, der als . bekannt ist Polymerase Kettenreaktion, oder PCR. Die PCR erstellt Kopien der DNA, ähnlich wie die DNA in einer Zelle selbst kopiert, und produziert fast jede gewünschte Menge des genetischen Materials.

Nachdem die fragliche DNA amplifiziert wurde, untersucht die STR-Analyse, wie oft sich Basenpaare an bestimmten Loci oder Orten auf einem DNA-Strang wiederholen. Diese können Dinukleotid-, Trinukleotid-, Tetranukleotid- oder Pentanukleotid-Wiederholungen sein, dh Wiederholungen von zwei, drei, vier oder fünf Basenpaaren. Forscher suchen oft nach Tetranukleotid- oder Pentanukleotid-Wiederholungen in Proben, die einer PCR-Amplifikation unterzogen wurden, da diese am wahrscheinlichsten genau sind.

Das Federal Bureau of Investigation (FBI) hat 20 spezifische STR-Loci als Standard für die DNA-Analyse ausgewählt. Im Januar 2017 wurde diese Zahl von 13 auf 20 erweitert.


STR-Typisierung: Methode und Anwendungen

Der Streifzug von The Primer in diesem Monat in molekulardiagnostische Techniken wird eine Methode behandeln, die als Short Tandem Repeat (STR)-Typisierung bekannt ist. Die STR-Typisierung ist eine Methode, die am häufigsten in der molekularen Forensik verwendet wird, aber sie wird zunehmend auch im molekularpathologischen Labor als Methode zur Verwendung (oder Rückgriff, falls erforderlich) zur Verfolgung und/oder Bestätigung der „Identität“ von Gewebe verwendet Proben. Während die erstere Anwendung in TV und Filmen mehr Bildschirmzeit erhält, werden im letzteren Kontext wahrscheinlich mehr Leser auf die Methode stoßen. Wie wir jedoch sehen werden, ist die eigentliche Methode bei beiden Anwendungen identisch.

Kurze Tandemwiederholungen verstehen

Wir beginnen damit, dass wir uns überlegen, was ein STR eigentlich ist. Im gesamten menschlichen Genom gibt es eine große Anzahl von Stellen („Loci“), an denen nicht-kodierende DNA-Sequenzen aus einem kurzen (normalerweise 3 oder 4) Nukleotidelement bestehen, wie „CGG“ oder „ACAG“, das als Satz vorkommt von konkatameren Wiederholungen. Für unsere Beispiele wäre dies „CGGGCGGCGG….CGG“ bzw. „ACAGACAGACAG….ACAG“. Wenn die DNA-Replikation durch diese Art von Elementen erfolgt, kann eine bestimmte Art von Fehler auftreten: Wenn sich der entstehende (wachsende) Strang kurzzeitig von der Matrize löst, kann er beim erneuten Anlagern effektiv mit einem „Slippage“ um eine Einheit Anzahl der Wiederholungen, wodurch fast die gesamte Basenpaarung wiederhergestellt werden kann. Das heißt, nach Denaturierung und Reannealing des entstehenden Strangs an die Matrize kann die Polymerase „vor“ oder „hinter“ sein, wo sie war, als sie sie verließ. Wenn die Replikation wieder beginnt, hat der entstehende Strang dann entweder einige der Template-Wiederholungen „übersprungen“ oder sie zweimal als Template gelesen. Die erste führt zu einem Tochter-DNA-Strang mit einem Verlust einer Einheitszahl der STR-Wiederholungen, während die zweite zu einem Tochterstrang mit einer erhöhten Anzahl von STR-Wiederholungen führt.

Wie oft tritt dieser Polymerase-„Slippage“ in einer STR-Region auf? Die Häufigkeit kann mit einer Reihe von Faktoren variieren, aber die allgemeine Antwort lautet: selten, aber so häufig, dass eine Population eine Reihe von STR-Wiederholungszahlen an einem bestimmten Locus aufweist.

Während STR-Loci im gesamten menschlichen Genom verstreut vorkommen, ist eine kleine Anzahl besonders gut verstanden. Dies sind solche, die in einer Region vorkommen, die von hochkonservierten einzigartigen Sequenzen flankiert wird, so dass die einzigartigen Sequenzen nicht zu nahe beieinander und nicht zu weit voneinander entfernt sind, um eine effektive PCR-Amplifikation basierend auf Primern gegen die einzigartigen Regionen (ungefähr 50 bis 500 Basen .) zu ermöglichen Paare). Wenn ein solches STR-Element existiert, ist es möglich, PCR-Primer gegen die flankierenden konservierten Regionen zu entwerfen und zu wissen, dass der Primersatz (dank der Konservierung) ein Produkt aus jeder intakten menschlichen DNA-Probe amplifiziert. Wenn sich die fraglichen STR-Loci wie die meisten auf einem Autosom befinden, dann hat eine menschliche DNA-Probe zwei Loci-Kopien (eine von maternaler DNA, eine von väterlicherseits), sodass zwei PCR-Produkte amplifiziert werden. Das wichtige Detail hier ist, dass wir zwar wissen, dass sich ein PCR-Produkt (oder zwei Produkte) bilden wird, aber wir wissen es nicht a priori wie lange die Produkte sein werden. Diese Länge hängt von der Anzahl der STR-Wiederholungen zwischen den PCR-Primerstellen ab. Die nützlichsten STR-Loci sind solche, bei denen Populationsstudien eine große Vielfalt an Wiederholungen gezeigt haben – sagen wir 5 bis 30. Dieser Bereich von 25 „Wiederholungszahlen“ für ein Trinukleotid-Wiederholungselement würde zu einem Bereich von 75 Basenpaaren führen ( dh 25 x 3) möglicher Amplikongrößen, in Schritten von drei Basen pro Wiederholung.

Bekannt durch Loci-Namen wie „D1S80“ oder manchmal für nahegelegene Gene „TPOX“, erfüllen eine bestimmte Handvoll STR-Loci diese Nützlichkeitskriterien und sind gut untersucht, mit veröffentlichten Primer-Sets für ihre Amplifikation und bekannten Populationsstatistiken für einzelne Wiederholungszahlen an jedem Locus – das heißt, für einen Locus in einer bestimmten ethnischen Population werden einige Wiederholungszahlen häufig gefunden und andere weniger häufig.

Einen DNA-Fingerabdruck finden

Stellen Sie sich vor diesem Hintergrund vor, wir nehmen ein Primer-Set für einen autosomalen STR-Locus und führen eine einfache Endpunkt-PCR an einer menschlichen Probe durch. Am Ende der PCR analysieren wir die PCR-Produkte auf ihre Größe. Da wir nach 3-nt- oder 4-nt-Schritten suchen, bietet uns die Gelelektrophorese keine ausreichende Auflösung, um Produkte zu unterscheiden, die sich durch eine oder zwei Wiederholungszahlen unterscheiden Nukleotid. Unser Beispiel kann ein Produkt in einer einzigen Größe zeigen (was darauf hinweist, dass beide Loci-Kopien die gleiche Wiederholungsnummer hatten), oder es kann zwei Produkte zeigen, die sich in den Wiederholungszahlen unterscheiden (Abbildung 1). Für die untersuchten Loci kennen wir jetzt die mit dieser DNA-Probe verbundenen Wiederholungszahlen.

Stellen Sie sich nun vor, wir nehmen eine zweite DNA-Probe und wiederholen das Experiment. Wenn wir dies tun und wir ein anderes Ergebnis erhalten als bei der ersten Probe, haben wir die unausweichliche Schlussfolgerung, dass die beiden DNA-Proben von verschiedenen Individuen stammen. Wenn wir stattdessen dieselben Ergebnisse wie die erste Probe erhalten, können wir jedoch nicht sagen, dass die Proben von derselben Person stammen. Dies liegt daran, dass es möglich ist (bis zu einem gewissen statistischen Niveau, abhängig von der Populationshäufigkeit des Ergebnisses, das für diesen Locus erhalten wurde), dass eine andere Person die gleichen Wiederholungszahlen wie diese Loci hatte.

Die Technik gewinnt an Kraft, wenn wir in jeder Probe mehrere STR-Loci testen. Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei Stichproben genau übereinstimmen, nimmt schnell ab, wenn wir mehr Loci untersuchen. Ein häufig verwendeter kommerzieller STR-Test untersucht 16 Loci (15 autosomal und ein Sonderfall, der weiter unten diskutiert wird) mit behaupteten Spezifitätsraten (d. h. Wahrscheinlichkeit, dass zwei Individuen allen Loci entsprechen) von 1 von 1,8 × 10 17 Individuen oder mehr. das heißt, ein Vielfaches der gesamten menschlichen Bevölkerung des Planeten! Allgemein als „DNA-Fingerabdruck“ bezeichnet, mit Wahrscheinlichkeiten dieser Größenordnung ist es kein Wunder, dass DNA-Beweise zunehmend für forensische und kriminelle Zwecke verwendet werden – sowohl in der populären Unterhaltung als auch in der realen Forensik.

Sinnvolle Beziehungen

Zusätzlich zum Bestimmen (oder Widerlegen) der Identität zwischen zwei Proben kann die Technik auch verwendet werden, um die Verwandtschaft zu bestimmen. Die Hälfte der STR-Loci-Wiederholungszahlen einer Person sollte mit Werten aus der mütterlichen Quelle und die andere Hälfte aus der väterlichen Quelle übereinstimmen. Geschwister sollten im Allgemeinen an einem Viertel der Loci zueinander passen und so weiter, durch einfache mendelsche genetische Beziehungen. Eine detaillierte statistische Analyse (einschließlich der Populationshäufigkeit der bestimmten beobachteten STR-Typen) kann verwendet werden, um Daten dieser Art zu verfeinern und den Grad der Verwandtschaft zwischen Stichproben mit einer bekannten statistischen Wahrscheinlichkeit zu beweisen oder zu widerlegen. Beachten Sie, dass seit de novo Es können STR-Slippage-Ereignisse und/oder experimentelle Fehler auftreten, eine einzelne Nichtübereinstimmung mit erwarteten Werten widerlegt die Verwandtschaft nicht definitiv eine Übereinstimmung über die verbleibenden Loci kann immer noch ausreichen, um eine hohe Verwandtschaftssicherheit zu haben.

Nun, da wir verstehen, wie diese Methodik auf die gängigen Anwendungen angewendet wird, was ist mit den banaleren? Die Leistungsfähigkeit und Einfachheit der STR-"Fingerprinting"-Methode, kombiniert mit ihrer leichten Verfügbarkeit in vorgefertigten, optimierten Kit-Formaten, die problemlos auf Laborgeräten ausgeführt werden können, die im molekularpathologischen Labor im Allgemeinen bereits vorhanden sind, machen sie zu einem nützlichen Werkzeug zur Verfolgung und/oder Bestätigung der Verwandtschaft in Proben (oder Probenstücken). Betrachten Sie einen Fall wie eine potenzielle Tumorbiopsie, bei der mehrere kleine Gewebestücke in einen einzigen FFPE-Block eingebettet werden können. Es wird eine routinemäßige immunhistochemische Analyse durchgeführt, und das Ergebnis zeigt, dass die meisten Gewebestücke nicht krebsartig sind, während ein einzelnes kleines Stück dies ist. In Fällen wie diesem könnte dem Pathologen die Sorge sein, ob tatsächlich alle Gewebestücke aus derselben Probe stammen – oder ob irgendwie ein „Floater“ aus einem anderen Fall in den Block gelangt ist? Bei sorgfältiger Absicherung sind solche Fälle nicht ausgeschlossen und können schwerwiegende Folgen für den Patienten haben. Die STR-Typisierungsmethode kann in einem solchen Fall ein sehr nützliches Werkzeug sein, in dem ein mikroskopischer Schnitt des betreffenden Gewebestücks als Vorlage für einen DNA-Fingerabdruck dienen kann, während eine Referenzprobe des Patienten einen anderen liefert. Eine Übereinstimmung bestätigt die „Verwandtschaft“ (oder nicht) des Gewebestücks und des Patienten und stellt die korrekt zugeordnete Diagnose sicher.

Ein besonderer STR-Locus auf den Geschlechtschromosomen wurde oben erwähnt. Im Amelogenin-Gen auftritt, ist dies nicht unbedingt ein klassischer STR, bei dem die Größe eines Wiederholungselements eher variieren kann, sondern es stellt sich heraus, dass die Version des Amelogenin-Gens auf dem X-Chromosom getragen wird (AMELX zweimal bei Frauen und einmal bei Männern). ist nicht genau längenidentisch mit der gleichen Region des Amelogenin-Gens, die auf dem Y-Chromosom getragen wird (AMELY einmal bei Männern). Ein Intron in AMELY enthält eine 6-Basen-Insertion relativ zum gleichen Intron in AMELX. (Man beachte, dass die kodierenden Genabschnitte identisch sind, da die Insertion in einem Intron erfolgt.) Bei Amplifikation durch Primer, die diese Region flankieren, sind von AMELY abgeleitete Produkte somit 6 bp länger als von AMELX abgeleitete. Der am häufigsten verwendete Primersatz für diesen Locus ergibt somit ein einzelnes 106 bp-Produkt (zwei Loci-Kopien, gleiche Größe) für DNA-Proben von Weibchen und ein 106/112 bp-Duplettprodukt (eines von jedem Locus) von Männchen. Dieser Single-Locus-Test schließt somit effektiv etwa die Hälfte der Bevölkerung als mögliche Quellen für jede gegebene DNA-Probe ein (oder aus) und wird routinemäßig in STR-Typisierungspanels aufgenommen. Aufgrund seiner Größe ist dieser Locus auch auf einem Agarosegel mit guter Technik kaum zu unterscheiden, was ihn zu einer guten Demonstration des Gesamtansatzes im Klassenzimmer macht, ohne dass ein Kapillarsequenzer-Instrument benötigt wird.

Was ist mit Mischproben? Bei der oben beschriebenen Methode wurde davon ausgegangen, dass jede getestete Probe aus einer einzigen Quelle stammt und funktioniert am besten in dieser „perfekten“ Situation. In realen Fällen mit kleinen proportionalen Mengen anderer DNA funktioniert die Methode jedoch immer noch. Die primäre Matrize ergibt den Großteil des Produkts, wobei kleine Produktmengen aus der kontaminierenden Matrize stammen. Kapillarsequenzer zeigen die tatsächliche Peakfläche für jedes erkannte Produkt an, sodass die Primärprobe einen Hauptsatz von Peaks mit kleinen Seitenpeaks zeigt, die auf Verunreinigungen zurückzuführen sind.

Zurückkehren zu Abbildung 1: eine Skizze der hypothetischen STR-Ergebnisse für vier STR-Marker „A“, „B“, „C“ und „D“. Die Proben 1, 2 und 3 stellen drei verschiedene Proben dar, die auf diese Marker getestet wurden, als Rohergebnisse der Kapillarelektrophorese. Jede Probe enthält zwei feste Größenstandards „R1“ und „R2“, die verwendet werden, um die Übereinstimmung der Ergebnisse zwischen den Proben sicherzustellen. Jedes Elektropherogramm selbst zeigt die Signalstärke gegenüber der Produktgröße und ist in die Bereiche „A“, „B“, „C“ und „D“ unterteilt. Jede Region repräsentiert den erwarteten Bereich möglicher Amplikongrößen vom gleichnamigen STR-Marker. Betrachtet man Probe 1, so ist ersichtlich, dass die Quelle für STR-Größen bei den Markern A, C und D heterozygot ist (zwei verschiedene Produkte, die bei spezifischen Größen gebildet wurden), aber homozygot für beide B-Marker-Allele ist. (Es gibt zwei Produkte von identischer Größe, die einen einzelnen Peak ergeben.) Probe 2 hätte eine sehr geringe genetische Verwandtschaft zu Probe 1 Beachten Sie, dass in dieser Probe die STR-Marker B, C und D heterozygot sind, während A homozygot ist, und dass im Allgemeinen stimmen nur wenige Allelgrößen zwischen den Proben 1 und 2 überein. Im Gegensatz dazu ist Probe 3 genau die gleiche wie Probe 1, was auf Identität (oder zumindest einen hohen Grad an Verwandtschaft) schließen lässt. Ein echtes STR-Ergebnis würde diesem ähnlich aussehen, jedoch mit mehr Markern, was eine größere statistische Aussagekraft bei der Erkennung von Nicht-Beziehungen ermöglicht.

John Brunstein, PhD, Mitglied der MLO Editorial Advisory Board, ist Präsident und CSO der in British Columbia ansässigen PathoID, Inc.


Roepat Str - Geschichte

Der größte Teil unserer DNA ist identisch mit der DNA anderer. Es gibt jedoch vererbte Bereiche unserer DNA, die von Person zu Person variieren können. Variationen in der DNA-Sequenz zwischen Individuen werden als "Polymorphismen" bezeichnet. Wie wir in dieser Aktivität entdecken werden, sind Sequenzen mit dem höchsten Polymorphismus sehr nützlich für die DNA-Analyse in forensischen Fällen und für Vaterschaftstests. Diese Aktivität basiert auf der Analyse der Vererbung einer Klasse von DNA-Polymorphismen, die als "Short Tandem Repeats" oder einfach STRs bekannt sind.

STRs sind kurze DNA-Sequenzen, normalerweise mit einer Länge von 2-5 Basenpaaren, die zahlreiche Male in Kopf-Schwanz-Manier wiederholt werden, dh die 16 bp-Sequenz von "gatagatagatagata" würde 4 Kopf-Schwanz-Kopien des Tetramers "gata" darstellen. . The polymorphisms in STRs are due to the different number of copies of the repeat element that can occur in a population of individuals.

D7S280

D7S280 is one of the 13 core CODIS STR genetic loci. This DNA is found on human chromosome 7. The DNA sequence of a representative allele of this locus is shown below. This sequence comes from GenBank, a public DNA database. The tetrameric repeat sequence of D7S280 is "gata". Different alleles of this locus have from 6 to 15 tandem repeats of the "gata" sequence. How many tetrameric repeats are present in the DNA sequence shown below? Notice that one of the tetrameric sequences is "gaca", rather than "gata".


TH01

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The Geriatric Patient

Steven J. Schwartz MD , Frederick E. Sieber MD , in Anesthesia and Uncommon Diseases (Sixth Edition) , 2012

Diagnosis and Differential

The DNA-repeat expansion forms the basis of a diagnostic blood test for the disease gene. Patients having 38 or more CAG repeats in the Huntington's disease gene have inherited the disease mutation and will eventually develop symptoms if they live to an advanced age. Each of their children has a 50% risk of also inheriting the abnormal gene a larger number of repeats is associated with an earlier age at onset. Huntington's can also be diagnosed by caudate atrophy on magnetic resonance imaging (MRI) in the context of an appropriate clinical history.

Differential diagnosis of Huntington's disease includes other choreas, hepatocerebral degeneration, schizophrenia with tardive dyskinesia, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and other primary dementias and drug reactions.


Performing STR Analysis

This method differs from RFLP since in STR analysis DNA is not cut with restriction enzymes. Probes are attached to preferred regions on the DNA, and a PCR is employed to discover the lengths of the short tandem repeats.

The whole process for STR typing comprisesof collection of sample, extraction of DNA, quantisation of DNA, amplification of multiple STR loci by PCR, separation and sizing of STR allele, STR typing followed by profile interpretation, and possibly a report of the statistical significance of a match. Current forensic systems apply 10 (e.g. United Kingdom) or 13 (e.g. United States) STR loci. Kits with PCR primers for the standard STR loci are available commercially.

Numerous PCR reactions are performedconcurrently in a single tube at different STR loci, which give several products (two for each locus). The required components are as follows:

§ A DNA sample, e.g. blood or buccal cells from a suspect or a tissue, hair, nail from the scene of a crime

§ Two oligonucleotide PCR primers: one unlabelled reverse primer and one primer labelled at the 5 ′ -end with 32 P

§ A DNA polymerase (thermos table)

§ Four deoxynucleoside triphosphates which are as follows: dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

The labelled PCR products separate according to size when run on a polyacrylamide gel. DNA ladder is obtained and works as characteristic of an individual (Fig.7) .



Repeat specific rows or columns on every printed page

If a worksheet spans more than one printed page, you can label data by adding row and column headings that will appear on each print page. These labels are also known as print titles.

Follow these steps to add Print Titles to a worksheet:

On the worksheet that you want to print, in the Page Layout tab, click Print Titles , in dem Seiteneinrichtung Gruppe).

Notiz: The Print Titles command will appear dimmed if you are in cell editing mode, if a chart is selected on the same worksheet, or if you don’t have a printer installed. For more information about installing a printer, see finding and installing printer drivers for Windows Vista. Please note that Microsoft has discontinued support for Windows XP check your printer manufacturer's Web site for continued driver support.

Auf der Blatt tab, under Print titles, do one—or both—of the following:

In dem Rows to repeat at top box, enter the reference of the rows that contain the column labels.

In dem Columns to repeat at left box, enter the reference of the columns that contain the row labels.

For example, if you want to print column labels at the top of every printed page, you could type $1:$1 in dem Rows to repeat at top box.

Tip: Sie können auch auf klicken Collapse Popup Window buttons at the right end of the Rows to repeat at top und Columns to repeat at left boxes, and then select the title rows or columns that you want to repeat in the worksheet. After you finish selecting the title rows or columns, click the Collapse Dialog button again to return to the dialog box.

Notiz: If you have more than one worksheet selected, the Rows to repeat at top und Columns to repeat at left boxes are not available in the Seiteneinrichtung Dialogbox. To cancel a selection of multiple worksheets, click any unselected worksheet. If no unselected sheet is visible, right-click the tab of a selected sheet, and then click Ungroup Sheets on the shortcut menu.